组织脱水是病理制片很重要的一环,间接影响到后面的染色结果,因为现在多数是全封闭式脱水机脱水,所以脱水环节往往容易被忽视,今天咱们就聊一聊脱水那些事儿。
原理:
组织在固定液长时间浸泡后,会含大量的水分,为了制片和长时间保存,必须将水分置换成石蜡。
水和石蜡是不相溶的,水也不溶于二甲苯,但水溶于乙醇,乙醇和石蜡都可以溶于二甲苯,所以利用乙醇和二甲苯作为媒介,最终将组织中的水分替换成石蜡。
流程:
明白了原理,那流程就简单了,自然是依次浸入乙醇、二甲苯、石蜡了。
梯度酒精(乙醇)的原始是将组织内水分置换出来,二甲苯是将组织内酒精置换出来,最后石蜡是将组织内二甲苯置换出来,最终用于标本固定,方便包埋和切片。
但组织突然进入高浓度乙醇会发生收缩和变形,不利后续包埋、切片、染色,所以乙醇要从低浓度到高浓度依次进行(梯度酒精),且不要在高浓度时间过久。研究表明乙醇脱水能力在60%-95%浓度之间是相对稳定,低于60%的乙醇脱水能力下降明显,初始乙醇浓度低于50%,会很快失去脱水效应。
因水分被溶剂(如二甲苯)取代,二甲苯与玻璃的折光率非常接近,都是1.5左右,我们用光学显微镜观察,感觉组织块变得透亮,因此称之为透明。
最后是浸蜡,温度为刚刚超过石蜡熔点53℃为宜,熔点58-60°的石蜡,蜡缸温度设置62°为宜,太高可能会烫坏组织。
注意事项:
1. 取材一定不要太厚,最理想是2cmX2cmX3mm大小,固定不好,也会影响脱水及后续染色;
2. 乙醇和二甲苯不要同时更换,防止组织变脆;
3. 乙醇作为最常用的脱水剂,脱水能力较强,对组织有较明显的收缩作用,为避免过度收缩导致后面乙醇无法浸到组织内部,故起始浓度最好为70% 乙醇水溶液,随后是95% 乙醇和无水乙醇。
4. 我们在实践中发现组织在95%酒精中时间长 有 利 于 组织脱水,但要控制组织在纯酒精中的停留时间,以每道1~2小时为佳,组织不易收缩变硬。
5. 我们在工作中体会到,在固定、 脱水及透明过程中设定的温度参数大于35℃极易引起组织变硬和收缩现象。因此所设的温度参数一般为35℃以下。
6. 除脱水外固定后水洗也是影响切片质量的一个重要因素,水洗不够彻底容易造成脱片和染色不鲜对于需做免疫组化的组织由于固定后残余的福尔马林不利于组织内抗原的保存因此充分水洗尤为重要。初始程序为机洗0.5h并且设置一定时间轮换使液体中积存大量福尔马林从根本上说并未达到冲洗的目的;而新程序则改为流水冲洗0.5h不仅保证每次清洗都是新鲜清水,而且流水的冲刷力能更好的去除福尔马林溶液。
7. 二甲苯致癌,更换实验人员注意做好防护,在通风橱内更换。