AX-1任务ACC太空实验报告 | 无定形碳酸钙 (ACC)加速骨髓间充质干细胞和肌肉细胞的分化和成

ACC太空实验就是在AX-1任务中完成的

Figure 1. Assembly of SpacePharma SPIC2 3.5U Microgravity Lab showing the internal elements: service module comprising an on-board computer (OBC) and professional cir-cuit design (PCD) electronics, temperature control unit, fluid handling system, liquid reservoirs, manifold which directs the fluid flow, microscope, and spectrometer.

流体处理系统 - 由用于溶液和试剂的主动和被动泵和储液罐组成，是模块化的，并通过“即插即用”模式连接到每个基于微流体的芯片实验室。

Figure 2. 1 Illustration and an image of the customized microfluidic lab-on-chip (LOC). The LOC is made of polystyrene and is composed of 4 separated flow chambers, split into duplicate reaction of volume 60µl each. Each cell type had two duplicates experimental (ACC) and con-trol (CaCl2). Each duplicates had its own inflow/outflow ports. Before cell seeding, the cham-bers were flushed with 70% EtOH, DMEM/F12 without serum and coated with fibronectin at a concentration of 0.01mg/ml for 20 minutes. Chambers (slots) were washed from the fibronectin, with DMEM/F12 without serum. Cells (osteoblasts and myocytes) were seeded 2 days before launching into space and kept under controlled temperature (37°C) and medium perfusion. Once in space the SPIC2 system automatically controlled the temperature and media feeding into the different devices. Cell viability was monitored using an embedded miniatured micro-scope. 

Figure 3. SpacePharma SPIC2 3.5U Microgravity Lab inside the International Space Station (ISS) accommodated in the ICECUBES module.

Figure 4. Representative images showing Alizarin Red staining of MBA-13 osteoblasts cells following 10 days in culture as a function of various medium treatments. (A) MSCgo differentiation medium + ACC, (B) MSCgo differentiation medium + CaCl2, (C) MSCgo differentiation medium only, and (D) MSC-NutriStem complete proliferation medium (negative control).Note the intense signal from large calcium plaques deposited by cells treated with ACC enriched medium - group A.Figure 4E. The staining intensity was determined using ImageJ software Pixel Counter application, as indicated in Materials and Methods. Higher staining intensity was obtained in the ACC group. Figure 4F. Fold Change of the staining intensity, in comparison to the positive control (MSCgo only, 4C).

Figure 5. Representative images showing Alkaline phosphatase staining of MBA-13 osteoblasts cells fol-lowing 10 days in culture as a function of various medium treatments. (A) MSCgo differentiation medium + ACC, (B) MSCgo differentiation medium + CaCl2, (C) MSCgo differentiation medium only, and (D) MSC- NutriStem complete proliferation medium (negative control). Note the intense staining obtained for cells treated with medium enriched with ACC indicating that addition of ACC accelerates bone maturation of calcium deposition.

Figure 6. Representative images showing MDX cell lines treated with (A) MSCgo differentiation medium + ACC, (B) MSCgo differentiation medium + CaCl2 and (C) MSCgo differentiation medium only. Cells were stained with Alizarin Red 10 days following seeding. Note that no staining was seen in all treatments in-dicating that the presence of ACC does not cause false staining. Similar culturing experiments performed with many types of cells (aside osteoblasts) have demonstrated similar observations.

Figure 7. Representative microscope images of stained cells from cultures containing ACC in a previ-ous space experiment. (A) In Space. (B) On Earth. The differentiation period at the ISS was 2 weeks and 3 weeks on earth. Intense formation of calcium deposition was observed in both in-space and on-earth experiments with ACC demonstrating the formation of mature Osteocytes (bone cells). The results ob-tained in the presence of ACC at extraterrestrial conditions were similar to those observed on earth, or even slightly better, indicating the benefits of the ACC presence in microgravity conditions. Figure 7C. The staining intensity was determined using ImageJ software Pixel Counter application, as indicated in Materials and Methods. Non-significant differences in staining intensity, was obtained in the space group. Statistic analyzed using t-Student test.

Figure 8. Representative microscope images of MDX muscle cell cultured with the addition of ACC or CaCl2 (as a control). All samples contained final Ca2+ ions concentration of 2 mM. Cultures were fixed at the indicated days and stained with Giemsa. Note the enhancement in myotubes/muscle fiber formation in cultures exposed to ACC starting from day 5. The original magnification was x100.

Figure 9A. Representative fluorescence microscope images showing enhancement of myotubes formation by ACC. MDX muscle cells extracted from newborn mice MDX thigh muscle were cultured with the addition of ACC or CaCl2. All samples contained final Ca2+ concentration of 2 mM. Cultures were fixed at the indicated days and stained with Fluorescent Myosin antibody. Note the enhancement in myotubes formation in cultures exposed to ACC starting from day 3. Original magnification X100.Figure 9B. The fluorescence intensity was determined using ImageJ software Pixel Counter ap-plication, as indicated in Materials and Methods. All fold changes were calculated from the CaCl2 fluorescent intensity on day 2 (FC=1). Higher fluorescence intensity was obtained in the ACC group.

Figure 10. Effect of ACC on formation of muscle myotubes. Representative microscope images of primary skeletal muscle cells. Normal primary skeletal muscle cells extracted from newborn rat were seeded in culture medium containing 1mM Ca2+ enriched with additional 1mM Ca2+ originated from ACC, CCC or CaCl2 solutions. Cultures were fixed after 4 or 10 days and stained with Giemsa. Note that cultures enriched with the ACC contains significantly longer and thicker myotubes compared to cultures enriched with CCC or CaCl2. Original magnification x 40. 

Figure 11. Representative phase-contrast microscope images illustrating the effect of the ACC, in space, on Human BM-MSC Alizarin Red stained cells. (A) BM-MSC growing in MSCgo medium with ACC and (B) without ACC. Note intense formation of calcium deposition is observed in cells with ACC in comparison with the culture without it.Figure 11C. The staining intensity was determined using ImageJ software Pixel Counter applica-tion, as indicated in Materials and Methods. Significant differences were obtained between the control group (CaCl2) (n=7, number of images is lower than from the ACC group, since much fewer cells were survived) and the ACC treated group (n=12). Results are from different images. Statistic analyzed using t-Student test, (**** P value < 0.0001).

Figure 12. Representative phase-contrast microscope images illustrating the effect of the  ACC on Earth on Human BM-MSC Alizarin Red stained cells. The differentiation period was 6 days. (A) BM-MSC growing in MSCgo medium with ACC and (B) without ACC. Intense for-mation of calcium deposition is observed in cells with ACC in comparison with the absence of ACC. Figure 12C. The staining intensity was determined using ImageJ software Pixel Counter applica-tion, as indicated in Materials and Methods. Significant differences were obtained between the control group (CaCl2) (n=7), number of images is lower than from the ACC group, since much fewer cells were survived) and the ACC treated group (n=8). Results are from different images. Statistic analyzed using t-Student test, (**** P value < 0.0001).

Figure 13: Embedded space microscope images illustrating the effect of the ACC on Human BM-MSC's in space. The pictures were remotely captured by the microscope installed in the SPIC2 3.5U unit installed at the ISS. Slot 6 BM-MSC's without ACC: (A) Date: 07.4.22 Hour: 22:47; (B)Date: 11.4.22 Hour: 22:47; (C) Date: 15.4.22 Hour: 22:47. Slot 7 BM-MSC's with ACC: (D) Date: 07.4.22 Hour: 22:50; (E) Date: 11.4.22 Hour: 06:43; (F)Date: 15.4.22 Hour: 22:50. On the first day the concentration of the cells, in both groups is similar. In space, number of cells was decreased. The reduction in the group without ACC B & C is higher, in comparison to the ACC group E & F, demonstrating that cells with ACC survived better in comparison to the control group. BM-MSC's survived better in comparison to the muscle cells, see Figure 16. Those results coin-cide with the fact that the loss of muscle tissue is higher than loss of bone mass in space.

Figure 14: Representative phase-contrast microscope images illustrating the effect of the ACC on Human Muscle cells in space with Giemsa staining. Figures 14 A1 and A2 represent muscle cells growing in HI medium with ACC, and 14 B1 and B2 capture muscle cells growing in HI medium without ACC. Enhancement of muscle fiber cells formation and better survival was observed for the ACC treated group, in comparison with the cells grown without ACC.Figure 14C. The staining intensity was determined using ImageJ software Pixel Counter applica-tion, as indicated in Materials and Methods. Significant differences were obtained between the control group (CaCl2) (n=7), (number of images is lower than from the ACC group, since much fewer cells were survived) and the ACC treated group (n=18). Results are from different images. Statistic analyzed using t-Student test, (**** P value < 0.0001).

Figure 15: Representative phase-contrast microscope images illustrating the effect of the ACC on earth (control to the space experiment), on Human Muscle cells stained with Giemsa. Figures 15A represent muscle cells growing in HI medium with ACC, and 15B il-lustrate muscle cells growing in HI medium with CaCl2. Human muscle cell cultures were exposed to the following calcium compounds (final Ca2+ concentration of 2 mM): ACC primary nanoparticles or completely dissolved CaCl2. Enhancement of muscle fiber cells formation was observed in the ACC treated group, in comparison to the cells grown without ACC.Figure 15C. The staining intensity was determined using ImageJ software Pixel Counter application, as indicated in Materials and Methods. Significant differences were obtained between the control group (CaCl2) (n=13), and the ACC treated group (n=23). Results are from different images. Statistic analyzed using t-Student test, (**** P value < 0.0001).

Figure 16: Embedded space microscope images illustrating the effect of the ACC on Human Muscle cells, in space. The pictures were remotely captured by the microscope installed in the SPIC2 3.5U unit installed at the ISS. Slot 2 Muscle cells without ACC: (A) Date: 11.4.22 Hour: 22:36; (B) Date: 13.4.22 Hour: 22:36. (C) Date: 15.4.22 Hour: 22:36. Slot 3 Muscle cells with ACC: (D) Date: 11.4.22 Hour: 22:39; (E) Date: 13.4.22 Hour: 22:39; (F) Date: 15.4.22 Hour: 22:39. On the first day the concentration of the cells, in both groups is similar. In space, number of cells was decreased. The reduction in the group without ACC B & C is higher, in comparison to the ACC group E & F, demonstrating that cells with ACC survived better in comparison to the control group. The muscle cells were damaged from the microgravity environment more than the bone cells, which coincided with previously studies, re-ported that the loss of muscle tissue in astronauts, is higher than the loss of bone mass in space. In the presence of the ACC the muscle cells survived better, as demonstrated in figure 14.