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江苏艾康
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色谱双峰指的是明明是同种物质,但在色谱图中却呈现双峰,让实验人员误认为含有两种物质。那么,出现双峰的原因主要有哪些呢?今天小析姐和大聊聊,液相色谱出现“双峰”的原因。

在HPLC分析中,在色谱柱正常,样品浓度适,分析方合适,色谱峰在出峰时间较短的条件下,峰型应对称而尖锐。但在实际操作中,如果对样品不了解,前处不恰当或者分析方不合等,会出现峰形不正常的情况,其中双峰现象是液相色谱中常见的问题之。

出现色谱双峰的原因般有以下几种:

色谱柱

如果在样品分析时发现每个色谱峰都有双峰出现,尤其在采用物质时,则可以确定是色谱柱出现问题了,般是柱头受或者柱头固定相污染引起的。

如果进样量少,原来色谱柱正常,色谱峰的形状多为大峰带小峰,不定拖尾,这般应是柱头受堵,将色谱柱反过来接,用流动相冲洗或酸洗或其它溶,将堵在柱头的残留物冲掉,再反过来,般情况下行了。当然不反冲,正冲有时也会正常的。如果峰拖尾,双峰强弱相差不大,柱头固定相变脏或流失可能大,这时可以将进样头拧开,将微孔滤片超声,柱头刮去部分填料,重新填上新填料拧紧,不过这个对技术要求较高且不能经常做,否则用不了几次,色谱柱会应柱低而报废。如果上述不能解决问题,可能是柱塌陷造成的,此时需要换色谱柱。


溶问题

目前HPLC分析多为反相色谱,流动相多为甲-、乙腈、水,加各种添加以分离能。样品般用与流动相相溶的溶溶解,溶解方是用流动相溶解。在实际分析中,有时候为了样品的溶解或稳定加入了点的缓冲液,缓冲液的酸-可能会导致样品转化,从而产生双峰现象。此时需要换缓冲液,调整溶pH值,或者用流动相配置样品。

此外,样品要现配现用,避样品溶解液的有机相比例、pH值发生变化而导致的溶应。


进样量

当用溶强度大的试,如甲-、乙腈,乙-,而分析系中以水为主时,如果样品进样量大,如定量管为20ul,此时的物质会出现双峰,第二峰比di峰小(每次都不太样),且拖尾,保留时间会提前(相对进样量少而言),将进样量少半以上,峰型将变为正常。这是样品的溶与流动相相差太大,而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的,此情况下需要少进样量。

另个原因是,进样量不定大,但量很大,色谱图上的双峰紧靠在起,基本上齐高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样可以了,这是由于进样量过大,色谱柱过载造成的。



样品特

有些样品由于其结构的特点,存在互变异构现象,而这种互变异构无分开,而是以个动态平衡存在。在色谱分析时,在个特定的条件下(如pH值、流动相、温度等),种物质将出现双峰,双峰靠的很近,基本齐高,不拖尾,条件稍变化,尤其pH,双峰现象将消失,如红mei素等。

有的样品紫外的色谱图上看不到双峰,但在LC-MS下,用质谱测器,其质谱的总离子流图上较明显,如农啶虫眯(吡虫清)。


pH值

系pH值对色谱双峰的影响出现在各个环节上(前面已经提到),尤其在缓冲液流动相平衡过程中其影响为明显。当连续进样时,受pH的连续变化影响会经常遇到这种双峰的情况。另外,在样品分析时,流动相的pH尽量远离被分析物的等电点,否则也容易引起双峰的产生。在用离子对试分析时,选择不好条件也会容易引起双峰的产生。

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